Teen työkseni laboratoriossa mikrobien DNA:n ja RNA:n eristämistä ympäristönäytteistä, ja näiden mikrobien tunnistamista siitä eristetystä DNA/RNA:sta. Täsmälleen samoja menetelmiä käytetään tuossa Covid-19 testissä.
Taustaa:
Periaatteessa homma toimii niin että puikolla kerätään nielun limakalvoilta näyte, joka siirretään koeputkeen. Näytteestä erotellaan erinäisillä menetelmillä kaikki muu orgaaninen aines pois, niin että jäljelle jää ainoastaan
nukleiinihapot, DNA ja RNA. Kaikkien eliöiden DNA:ssa on tiettyjä alueita (geenejä) joiden emäsjärjestys ohjaa saman solu-organellin proteiinien muodostusta. Esimerkiksi kaikista esitumallisten (bakteerit ja arkeonit) eliöiden DNAsta löytyy 16S-ribosomaalinen DNA-geeni, joka määrittää miten näiden solujen ribosomit rakennetaan. Tämä geeni on noin 1500 emäsparia pitkä. Vaikka tämä geeni on hyvin vakaa, on siihen vuosimiljarien aikana syntynyt mutaatioita (yksittäisten emäsparien korvautumista toisilla). Nämä mutaatiot tapahtuvat niin harvakseltaan ja hitaasti, että
yhden lajin edustajilla on identtinen 16S rRNA geeni, mutta
lajien välillä voi olla yhden tai useamman emäsparin eroavaisuuksia tämän geenin rakenteessa. Tätä käytetään mikrobiologiassa apukeinona erilaisten mikrobien sukulaisuussuhteiden selvittämisessä. Mitä läheisempää sukua kaksi mikrobia on toisilleen, sitä vähemmän eroja niiden 16s rRNA geenissä on toisiinsa verrattuna. Meillä on olemassa tietokantoja joissa on tuhansien ja taas tuhansien mikrobien 16S rRNA geenin kokonaan selvitetystä emäsjärjestyksestä, ja kun löydetään uusia mikrobeja, verrataan niiden 16S rRNA emäsjärjestystä tiedossa oleviin mikrobeihin.
Jotta me voidaan tutkia tätä mikrobien DNAn emäsjärjestystä, meidän täytyy monistaa näistä näytteistä, kaiken sen eristetyn DNAn ja RNAn joukosta, yksittäisten geenien (kuten to 16S rRNA geeni), koska jo yhden mikrobin koko genomisen DNAn emäsjärjestyksen selvittämiseen menisi tuhottomasti työtunteja. Esimerkiksi
E. colin koko genomi (koko geneettinen perimä)
on yli 4,6 miljoonaa emäsparia pitkä.
DNAta voidaan monista PCR (Polymerase Chain Reaction) menetelmien avulla. Yksinkertaisuudessaan tämä homma toimii niin, että tehdään labrassa reaktioliuos jossa on:
- DNAn monistamiseksi tarvittava entsyymi
- vapaita nukleiinihappoja (DNAn rakennuspalaset)
- muutama muu reagenssi jotka eivät nyt ole tärkeitä
- Monistettavalle geenille spesifiset ALUKKEET (eng: primers) Alukkeet ovat noin 20 emästä pitkiä pätkiä DNAta, jotka sitoutuvat näytteen DNAssa ainoastaan sen geenin ympärille jonka monistamiseen ne on suuniteltu.
Nämä sekoitetaan koeputkessa, luios pipetoidaan PCR laitteeseen menevälle kuoppalevylle, ja mukaan laitetaan myös näytteestä eristetty DNA. DNA on näytteessä kaksoiskierteisessä muodossa. PCR laitteeseen ohjelmoidaan lämpötilaohjelma, jonka mukaan laite nostaa ja laskee reaktiolämpötilaa. Yksinkertaistettuna PCR reaktio on seuraava:
- Kuumentaminen noin 95 asteiseksi --> DNAn kaksoiskierre aukeaa
- Viilentäminen 55-65 asteiseksi alukkeet kiinittyvät DNAn juosteisiin monistettavaa geeniä reunustaville paikoille
- Kuumentaminen takaisin noin 72 asteiseksi --> Polymeraasi tarttuu kiinni alukkeisiin ja kasaa yksijuosteisen DNAn pinnalle vastaavan komplementaarisen DNA juosteen.
- Paluu takaisin vaiheeseen 1. noin 25-40 kertaa.
Mikäli näytteessä oli
geeni johon valitut alukkeet pystyivät sitoutumaan on reaktioliuoksessa PCR ajon jälkeen exponentiaalisesti monistunut pitoisuus kyseistä geeniä. QPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaktion) laitteet pystyvät mittaamaan kuoppalevyn kuopissa olevan lioksen DNA pitoisuutta mittaamalla kuopissa olevan reaktioliuoksen kykyä absorboida valoa. Laite piirtää tietokoneen näytölle kuvaajaan jokaista kuoppalevyn kuoppaa vastaavan absorbanssikäyrän josta voi sitten katsoa että onko kyseisessä kuopassa tapahtunut DNAn monistumista (
HUOM! joka tapahtuu ainoastaan jos näytteessä oli tutkittavaa geeniä)
Noniin, ja sitten miten tätä voidaan käyttää Korona viruksen tunnistamiseen näytteistä:
Korona viruksella ei ole tuota esimerkkinä mainittua 16S rRNA geeniä, koska kyseessä on virus. Lisäksi virusten perimä koostuu RNAsta, joka on yksijuonteinen, sisältää tukirangassaan erilaisen sokeriryhmän, ja DNAssa on tymiini emäksiä, ja RNAssa niiden tilalla on urasiilia.
RNA voidaan kääntää DNAksi ja monistaa RT-PCR (Reverse Transcription PCR, linkkaamassasi artikkelissa mainittu
) menetelmässä. Erona tuohon aikaisemmin kuvailemaani qPCR menetelmään on, että näytteestä tuhotaan ensin DNA jolla ei tässä tehdä mitään, ja RNA käännetään sen jälkeen DNAksi erinäisillä kaupallisesti saatavilla olevilla entsyymi-kiteillä. Kun kaikki näytteen RNA on käännetty DNAksi, voidaan näytteelle ajaa normaali qPCR. Koska Covid-19 vituksen emäsjärjestys on tiedossa, voidaan sillekin valmistaa
alukkeita jotka monistavat näytteestä DNAta, mikäli siinä vain oli koronavirusta.
Hyi tekstiseinä, mutta koitan tiivistää:
Korona-viruksen läsnäolo potilaassa (tai ympäristössä) voidaan selvittää PCR reaktiolla, jos saatavilla on:
- PCR laitteisto
- Tarvikkeet DNAn ja RNAn eristämiseksi näytteestä
- Kitti jolla voidaan tuhota näytteestä DNA ja muuttaa sen jälkeen näytteessä oleva RNA DNAksi
- Kitti joka sisältää reagenssit DNAn monistamista varten
- Covid-19 viruksen RNAsta tehdylle komplementaariselle DNAlle spesifiset alukkeet
Pullonkauloja tässä operaatiossa on reagenssien ja alukkeiden saatavuus. Varsinkin spesifisten alukkeiden saanti tarvittavissa määrissä voi tehdä hyvinkin tiukkaa, koska niitä ei ihan jokainen laboratorio pysty tekemään.
Lisäksi kaikkein tärkein,
eli tarvitaan laboratorio jolla on riittävä turvaluokitus tehdä näitä testejä ilman että koko henkilökunta ja lähipitäjät saavat tartunnan näytteiden käsittelyn seurauksena.
